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亦樊
氮元素是构成生物体最基本元素之一。动物可以从食物中以蛋白质、氨基酸等形式获取氮源，植物主要通过吸收无机的硝态氮和铵态氮来获取氮源，对大部分的植物而言，它们偏好硝态氮，当植物感受到硝态氮，会诱发植物根系和叶片的旺盛生长；而铵态氮只能维持植物的基本生长，而且很多植物存在铵盐*害问题。在农业生产中，硝态氮供给水平是影响农作物产量的重要因素。但硝态氮易溶于水，容易流失而造成环境污染。解析植物的硝态氮吸收、转运、代谢和信号转导具有重要的科学意义。
9月23日，西北农林科技大学刘坤祥教授课题组在Science发表了题为“NIN-likeprotein7transcriptionfactorisaplantnitratesensor”的研究论文。该研究发现，陆生植物中转录因子NLP7可以作为硝态氮的受体，为植物氮素营养领域的研究提供了新启示。
硝态氮除了作为植物生长过程中一种重要的矿质元素外，它还是一种重要的信号分子，可以诱导许多参与硝态氮吸收、代谢等途径基因的表达。在过去的几十年中，围绕植物吸收、代谢硝态氮，科研工作者进行了大量的研究，发现了硝态氮信号途径的基因，如：NRT1.1，CIPK23，NLPs，GATA，NAC，bZIP，CIPK8等(Brooksetal.,;Huetal.,;Vidaletal.,)。年有研究者在豆科植物百脉根中发现nin突变体不会形成根瘤，缺失了固氮作用，NIN基因编码了一个与根瘤形成相关的转录因子。年，有研究者在拟南芥中发现豆科植物NIN的同源蛋白-NLP7(NIN-LIKEProtein)，虽然拟南芥不形成根瘤来固氮，但研究发现nlp7突变体可以影响植物对氮的响应，但并没有进行更深入的研究。年，刘坤祥教授和同事发现的硝酸盐-CPK-NLP信号途径的阐明是硝酸盐信号转导研究的突破性进展，该研究发现硝态氮可以诱导细胞内钙离子的升高，进而激活钙依赖蛋白激酶第三亚家族成员的活性(CPK10/30/32)，激活的蛋白激酶可以磷酸化转录因子NLP7的第位丝氨酸，使其进入细胞核内调控基因的表达，进而促进植物的生长发育(Liuetal.,)。拟南芥中NLP家族有9个成员。研究表明，NLP2和NLP7对植物的营养生长比较重要，在以硝态氮为唯一氮源的条件下，nlp2和nlp7都表现出地上部分鲜重下降的表型，但NLP2和NLP7的功能并不能被相互取代(Konishietal.,)。因此，NLP基因家族成员在硝态氮信号途径中，功能有一定冗余性，但各成员之间又有其特殊的功能，因而深入研究NLP如何特异的调控下游基因表达具有重要的意义。
十多年来很多研究者都认为CHL1/NRT1.1是硝酸盐的感受器。但研究发现，虽然CHL1/NRT1.1是一个重要的转运蛋白，但并不是一个主要的硝酸盐感受器，因为chl1/nrt1.1突变体植物本身没有什么缺陷表型，而且chl1/nrt1.1突变体感受到外界硝酸盐后，除了个别基因不被诱导，大部分基因仍可以被诱导表达(有些基因只是表达降低了一些，没有完全消失)，其它的原初硝酸盐响应依然存在。所以除了CHL1/NRT1.1以外，植物应该还存在其它感受硝态氮的感受器存在。
在刘坤祥研究团队的这项最新研究中，发现了：
（1）NLP家族成员协同或差异性的影响了植物硝态氮响应
模式植物拟南芥NLP家族由9个成员(NLP1-9)，通过在拟南芥原生质体中分别过表达这些基因，通过RNAseq分析，NLP家族成员可以广泛的激活原初级硝态氮响应基因的表达，通过nlp2,4,5,6,7,8,9的七突变体分析表明，nlp2,4,5,6,7,8,9的七突变体几乎丧失了对硝态氮的反应，因而NLP蛋白在调控植物初级硝态氮响应中具有重要作用。
（2）硝酸盐通过NLP7蛋白的氨基端解除NLP7蛋白的自抑制
通过蛋白截断分析表明，NLP7蛋白的氨基端有一个硝酸盐响应的区域，在羧基端有一个转录激活的区域，在没有硝酸盐的时候，NLP7蛋白氨基端会抑制NLP7蛋白羧基端的转录激活作用，当硝酸盐存在的时候，硝酸盐通过结合NLP7蛋白的氨基端解除了对NLP7蛋白转录活性的抑制。在动物细胞中也能证实，硝酸盐可以激活NLP7蛋白的转录活性。
（3）硝酸盐直接结合NLP7蛋白
通过大肠杆菌可以表达纯化NLP7蛋白，然后通过微量热泳动仪(MST)和表面等离子体共振(SPR)这两种仪器可以检测到NLP7蛋白可以专一性的与硝酸根离子结合，而不与对照阴离子高氯酸离子结合，微量热泳动仪测出的NLP7蛋白与硝酸盐结合解离常数为52±20M。
（4）通过遗传改造的荧光硝酸盐感受器可以看到植物内的硝酸盐
基于NLP7蛋白结合硝酸盐的特性，将*色荧光蛋白柠檬*mCitrine切成两半分别接到NLP7蛋白的两端，构建了一个可以结合硝酸盐，蛋白结构发生变化，进而发出荧光的一个荧光硝酸盐感受器。用这个硝酸盐感受器可以看到对植物施加硝酸盐后，因荧光硝酸盐感受器结合硝酸盐发出的荧光，这反映植物体内硝酸盐与NLP7的结合。
（5）硝酸盐受体在植物中具有进化保守性
通过与已经报道的细菌硝酸盐受体的比较，本研究发现了NLP7上几个保守的氨基酸位点，通过对这些突变位点的筛选，在NLP7蛋白中找到了三个关键的位点(H,L,Y)。这些位点的突变抑制了硝酸盐诱导的NLP7转录活性、也抑制了硝酸盐与NLP7的结合，也不能恢复nlp7突变体的表型。并且这些位点在农作物中也具有广泛的保守性。因而可以推测NLP7蛋白以及它的类似蛋白在从轮藻类植物到被子植物的众多光合植物中都扮演了硝态氮受体的作用。这些研究表明，NLP7蛋白在植物的转录重塑和植物发育中扮演了核心转录激活因子和硝态氮受体的双重作用。
硝酸盐是生长在土壤中的光合自养型植物必需的营养盐，它控制对植物的营养生长和生殖生长至关重要的代谢和发育进程。然而工业上氮肥的生产既消耗大量能源又容易造成污染。而且，在农业中氮肥的大量使用在增加农作物产量的同时，也带来了全球范围的环境富营养化的灾难。局部地区和全球范围的研究也表明地球上氮的可利用性在减少。增加植物的氮利用效率对农业的可持续发展和生态系统的稳定健康发展都很重要。
这项研究表明，NLP家族的NLP2/4/5/6/7/8/9作为转录因子起始了硝酸盐诱导的转录重塑和物质运输、代谢、激素、信号转导和根系及地上部分的生长等发育进程。通过遗传学、基因组学、细胞学、生物化学和蛋白结构分析，该研究发现NLP7蛋白具有转录激活和细胞内硝酸盐感受双重的功能。硝酸盐结合后会造成NLP7蛋白结构的变化，进而解除NLP7蛋白自身的转录抑制作用。NLP7蛋白结合硝酸盐后的这些变化与前面已经发现的CPK对NLP7的磷酸化和细胞核驻留同时发生，协同起作用。
NLP7蛋白上的硝酸盐结合口袋与细菌的硝酸盐受体NreA蛋白在序列和结构上是进化保守的，在拟南芥NLP家族的其它成员和其它陆生植物以及轮藻类的淡水绿藻中的NLP7同源基因都具有这种保守性。有理由相信，除了NIN，这些NLP7同源基因和家族其它成员，在多种植物类型中都可能扮演了硝酸盐受体-转录因子这样的角色，它们在原初硝态氮响应中调控了许多植物营养调控网络中重叠以及不同基因的表达。
NLP7作用模式图
综上所述，该研究阐明了光合自养植物通过感受无机氮进而激活植物信号转导网络和生长反应的调节机制。该研究的发现将为提高作物的氮利用效率，减少化肥使用和能源消耗，减轻由温室气体排放引起的气候变化，进而支持农业的可持续发展提供新的启示。
西北农林科技大学生命科学学院博士研究生刘孟红、林子炜、哈佛大学Zi-FuWang与西农青年教师陈斌卿博士为该论文第一作者，刘坤祥教授为第一作者兼通讯作者，哈佛大学医学院JenSheen教授为共同通讯作者。此外，哈佛大学布拉瓦特尼克研究所、东京大学农业生物技术研究中心的研究者也参与了本项研究。该研究得到了国家自然科学基金的资助。
参考文献：
Brooks,M.D.etal.NetworkWalkingchartstranscriptionaldynamicsofnitrogensignalingbyintegratingvalidatedandpredictedgenome-wideinteractions.NatureCommunications10().
Hu,H.C.,Wang,Y.Y.Tsay,Y.F.AtCIPK8,aCBL-interactingproteinkinase,regulatesthelow-affinityphaseoftheprimarynitrateresponse.PlantJournal57,-().
Konishi,M.,Okitsu,T.Yanagisawa,S.Nitrate-responsiveNIN-likeproteintranscriptionfactorsperformuniqueandredundantrolesinArabidopsis.JournalofExperimentalBotany72,-().
Liu,K.H.etal.Discoveryofnitrate-CPK-NLPsignallingincentralnutrient-growthnetworks.Nature,-().
Vidal,E.A.etal.Nitrate:Thirtyyearsfromtransporttosignalingnetworks.PlantCell().
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